La producción masiva de bacterias requiere instalaciones adecuadas y un equipamiento más complejo, pero sobre todo condiciones de trabajo apropiadas a fin de mantener un ambiente que garantice la calidad del producto. Se requiere un control estricto de la esterilidad puesto que el pH y la temperatura óptimos de muchas bacterias permiten el desarrollo de todo tipo de contaminantes potenciales.
Algunos Productos Recomendados
Cabe recalcar una vez más que las bacterias o cualquier microorganismo que se quiera utilizar ya sea como biofertilizante o como biocontrolador debe ser preferiblemente del lugar o de la zona donde se lo quiera aplicar.
La primera etapa, una de las más importantes de este proceso, es entonces la prospección, selección y conservación de las cepas de trabajo. La prospección de nuevos aislamientos de bacterias debería ser permanente para así encontrar aislados más efectivos.
Así como en el caso de los hongos, el mantenimiento y la conservación de las bacterias seleccionadas es la garantía del éxito del proceso y del producto final.
La mayoría de las bacterias producidas con fines agrícolas se obtiene por fermentación sumergida en biorreactores de diversas escalas con la aireación y agitación adecuada a los requerimientos del microorganismo cultivado y con los accesorios y la automatización necesarias (pH, temperatura, etc.)
Suquilanda
Al producir bacterias se debe determinar si el interés es la biomasa o los metabolitos, a fin de definir las estrategias de producción y aplicación.
La producción de biomasa tiene la ventaja de que al ser aplicada en el suelo se multiplica y cumple sus funciones o interactúa con el patógeno en el caso de los antagonistas. Si se quieren obtener metabolitos hay que tomar en cuenta el momento en el que se obtienen las sustancias bioactivas.
Si bien el protocolo de producción de bacterias puede ser similar, tiene que ser ajustado a cada laboratorio pues cada uno tiene condiciones de trabajo muy propias que influyen en el proceso. Se recomienda por lo tanto iniciar con una curva de crecimiento de la bacteria hasta lograr optimizar el proceso.
Paso a paso para producir bacterias benéficas.
La producción de bioinsumos a base de bacterias requiere los siguientes materiales, equipos y procedimientos:
Materiales.
- Agar nutritivo
- Agar Ashby
- Caldo para fermentación
- Asa bacteriológica
- Coloración Gram
- Hisopos de algodón estériles
- Una caja con cultivo joven de una cepa de la bacteria a producirse
- Tubos con tapa rosca
- Tuberas
- Cajas Petri
- Frascos Schott de 100 y 1000 ml
- Tubo fusible de 4–5 mm
- Tapones de caucho
- Pipetas automáticas de 100 y 1000 µl.
Equipos.
- Motores de pecera y manguera siliconada de 4–5 mm
- Agitador orbital
- Biorreactor o biofermentador
- Autoclave
Elaboración.
Se parte de una caja de cultivo puro joven (24–48 horas) de la bacteria con crecimiento abundante. Se debe trabajar de forma aséptica, junto al mechero.
Producción de preinóculo 1.
Inocular 2 tubos de 7,5ml de medio de fermentación (g/l: 30 g de azúcar blanca, 4g de NH₄NO₃, 0,5g de KH₂PO₄, 0,5g de K₂HPO₄, 0,3g de MgSO₄, 5g de CaCl₂, 0,6 ml de solución de microelementos, pH 7,4–7,6) con un asa abundante en colonias de un cultivo joven de la bacteria e incubar 24h a 28°C (el tiempo varía según la bacteria).
Producción de preinóculo 2.
Preparar frascos Schott de 500ml con 135ml del medio de cultivo; asépticamente colocar todo el contenido de los tubos de preinóculo en los frascos Schott y fermentar en agitación a 130 rpm durante 24h a temperatura ambiente.
Inóculo: transferir el contenido del preinóculo 2 a un frasco con 1350ml del medio de cultivo para fermentación e incubar 24h en agitación a 150rpm a temperatura ambiente.
Fermentación: transferir el inóculo a un botellón con 12,5 l de medio de fermentación y añadir 20 ml de glicerina estéril como antiespumante, armar el equipo de fermentación, conectar la bomba para aireación y fermentar durante 26 h a temperatura ambiente.
Para escalar a mayor volumen
- Trabajar siempre con un inóculo que corresponda al 10 % del volumen final deseado;
- controlar que el pH se mantenga en 7,2 durante todo el proceso;
- controlar la pureza durante todo el proceso tanto por tinciones de Gram como por siembras en placa.
Envase: envasar en frascos limpios y preferentemente estériles y mantener en refrigeración hasta su utilización.
El medio de cultivo, pH y tiempo de fermentación pueden variar según la bacteria que se desea producir.
Pseudomonas fluorescens y Azotobacter spp.
- Tienen tiempos de fermentación de 18 y 26–28 horas respectivamente.
- Las dos bacterias crecen bien en el medio de cultivo antes señalado.
- Ambas pueden ser solubilizadoras de fosfatos y PGPR.
- Azotobacter spp. es fijadora de nitrógeno.
- fluorescens es usada también para biocontrol.
Para Bacillus thuringiensis (Bt), A. Bibi y otros (2013) recomiendan un medio que contiene:
30 g/l de sangre deshidratada.15 ml de melaza, 0,03 g de CaCl2 y 1,0 ml de solución de sales (ZnCl₂, MgCl₂, MnCl₂, CaCl₂, FeCl₃ y 5 gotas de HCl) en 1 litro de agua. El medio favorece la esporulación y la producción de cristales de toxina en una fermentación de 72 horas. En general el tiempo de fermentación para Bacillus spp. es de 72 horas.
Por otra parte D. Rivera y otros (2012) consiguieron el mejor desarrollo de Azospirillum spp. en un medio que contiene 3 g/l de sacarosa, 6,75 ml/l de melaza, 0,77 ml de glicerol, 14,42 ml/l de hidrolizado de soya, 0,848 g/l de hidrolizado de levadura, 0,25 g/l de K₂HPO₄, 3/5 de aireación y agitación a 120 rpm con un tiempo de fermentación de 26 horas.
Control de calidad de biopreparados a base de bacterias
Recuento en placa.
- Realizar diluciones seriadas en base 10 hasta 1010.
- Sembrar por triplicado, en cajas perfectamente rotuladas, las diluciones 107, 108, 109 y 1010 (1 ml de cada una).
- Añadir el agar nutritivo esterilizado y enfriado a 45 °C y homogeneizar con movimientos de rotación a la izquierda, a la derecha y en L. Dejar que el medio se solidifique.
- Incubar a 28 °C por 48 horas.
- Realizar el recuento de colonias desarrolladas y reportar como UFC.
Control de pureza.
Esta prueba determina la proporción del agente biológico y de los posibles contaminantes:
– En las cajas sembradas para recuento en placa contar las colonias de la bacteria en producción y las colonias de otros microorganismos (contar mínimo 200 colonias).
– Calcular el porcentaje de pureza con la fórmula:
Fuente: Libro de Suquilanda de control de plagas en agricultura orgánica.
Cómo producir bacterias benéficas – PDF
