Cómo producir hongos benéficos [Método laboratorio]

Producir hongos benéficos se ha convertido en una alternativa para mejorar la fertilidad del suelo y su capacidad productiva, así como para el manejo y control de plagas y enfermedades de los cultivos, ha conducido al desarrollo de bioinsumos que reemplacen a los agroquímicos, utilizando para ello microorganismos benéficos, en el marco de una agricultura sostenible.

Algunos Productos Recomendados

Existen diferentes opciones para la elaboración de biofertilizantes y biocontroladores. Para elaborar biocontroladores a base de microorganismos es fundamental utilizar cepas adecuadamente seleccionadas ya que diferentes aislados de un mismo microorganismo (género y especie) pueden mostrar comportamientos distintos.

La prospección de cepas es entonces el primer paso para obtener productos de buena calidad. Diferentes ensayos han demostrado que los microorganismos autóctonos son los más eficientes. Se deberá por lo tanto contar con un banco de cepas que contenga aislados de diferentes regiones y ecosistemas del país.

La prospección, selección y mantenimiento de las cepas es entonces una etapa primordial para garantizar la eficacia de la inoculación de microorganismos con aislados que realmente posean las características deseadas en su máxima potencia.

El mantenimiento y la conservación de las cepas seleccionadas son un requisito indispensable para garantizar el éxito del proceso y del producto final. Para la conservación se emplean diferentes métodos.

Entre los más utilizados están la crioconservación, la liofilización, el suelo estéril, el papel de filtro, etc., con el fin de evitar los subcultivos continuos que pueden causar mutaciones y pérdida de la virulencia o de cualquier otra característica deseable.

Posteriormente los aislados deben ser sometidos a un proceso de selección con bioensayos tanto in vitro como en campo para determinar su eficacia, su capacidad de producción de alguna sustancia o metabolito, su virulencia (en el caso de los controladores biológicos) y seleccionar aquellos que presentan mejores resultados. En ningún caso la obtención de un solo aislado es suficiente para llevarlo a producción.

Luego del proceso de selección se realizan ensayos de producción para establecer las condiciones, que serán diferentes para cada laboratorio según las circunstancias ambientales, el equipamiento, los insumos utilizados, etc.

Cada laboratorio deberá ajustar parámetros como temperaturas y tiempos del proceso, entre otros. A la hora de elegir los sustratos es necesario realizar un análisis en función de las necesidades del microorganismo que se desea producir, del balance de nutrientes, de los costos, de la disponibilidad, etc., de manera que se obtengan productos de óptima calidad a bajo costo.

Resumen.

La producción de bioinsumos (biocontroladores y biofertilizantes) a base de microorganismos benéficos debe tomar en cuenta algunos aspectos. A continuación se detallan los más relevantes:

1. Realizar una selección de la(s) cepa(s) adecuada(s) según la finalidad: una cepa de un microorganismo puede ser buena para un propósito y otra para otro, o puede haber cepas que reúnan varias características deseables para varios propósitos;
2. Seleccionar el medio de cultivo que tenga el balance de nutrientes requerido para un buen desarrollo del microorganismo, con bajo costo;
3. Tomar en cuenta la disponibilidad de recursos, instalaciones, equipamiento y suministros adecuados según el nivel de producción;
4. Formular un producto que tenga una adecuada vida en percha y permita una fácil aplicación y estabilidad en campo.

Pasos a seguir para producir hongos benéficos.

La producción de hongos tanto antagonistas como entomopatógenos conlleva una serie de procesos que determinan la calidad del producto y su eficiencia en campo. Se busca obtener un producto de alta calidad, con buena concentración, virulento y agresivo, al menor costo posible.

Como en el caso de cualquier microorganismo, en los hongos también se tiene que realizar un minucioso trabajo de prospección, selección y mantenimiento de aislados para llevar a procesos de producción los que presenten las mejores características.

En cuanto a la conservación de cepas de hongos, la crioconservación y el método de conservación en agua y aceite mineral son alternativas asequibles que brindan buenos resultados.

Existen muchas tecnologías para la producción masiva de hongos, tanto con fermentaciones sumergidas como con fermentaciones en sustrato sólido.

La producción de hongos antagonistas y entomopatógenos es similar. Algunos parámetros varían en función del hongo que se quiera producir. A continuación, se detalla el método de fermentación en sustrato sólido para la producción de hongos antagonistas y entomopatógenos.

Cómo producir hongos benéficos (antagonistas y entomopatógenos)

La producción de hongos antagonistas y entomopatógenos en sustrato sólido requiere los siguientes materiales, equipos y procedimientos:

Materiales necesarios para producir hongos benéficos:

• Cepa seleccionada del hongo
• Cajas Petri con PDA o Agar Extracto de Malta (AEM)
• Medio de cultivo líquido: caldo papa dextrosa
• Frascos Schott de 1 litro
• Asa de platino
• Asa de Drigalsky
• Ollas
• Matraces Erlenmeyer
• Vasos de precipitación
• Arroz
• Urea
• Agua
• Fundas de polipropileno de 1 kg de capacidad
• Tween 80 al 0,1 %
• Láminas porta y cubreobjetos
• Cámara de Neubauer
• Papel filtro

Equipos:

• Autoclave
• Agitador orbital
• Balanza
• Humidificador
• Aire acondicionado
• Cocineta

Procedimiento para producir hongos benéficos.

• Sembrar cajas Petri con PDA o AEM con el hongo que se va a producir.
• Incubar a 26 °C hasta conseguir su esporulación completa. El tiempo va a variar en función del hongo.

Preparación del inóculo.

• Lavar, pelar y pesar 250 g de papas. Hervirlas en un litro de agua por 30–35 minutos y filtrar. Se utiliza el agua de cocción y se afora a 1 litro para reponer lo que se evaporó.
• Colocar el medio de cultivo líquido preparado en frascos Schott o Erlenmeyer de un litro, a razón de 650–700 ml por frasco.
• Autoclavar el medio a 121 °C y 15 libras de presión por 20 minutos. Dejar enfriar.
• En forma estéril preparar una solución de esporas añadiendo 20 ml de Tween 80 al 0,1 % a cada caja del hongo esporulado. Con un asa de Drigalsky raspar suavemente la superficie para ayudar a desprender las esporas.
• Con una pipeta estéril añadir 5 ml de la suspensión de esporas a cada frasco con medio de cultivo. Tapar sin ajustar y llevar a un agitador orbital a 160 rpm por 3 días a 24–27 °C.

Preparación del sustrato.

• Calcular la cantidad de agua que se va a requerir y prepararla añadiendo 2 g de urea por cada litro de agua. Se calculan 170 ml de agua por funda de 26 × 36 cm.
• En cada funda colocar 700 g de arroz crudo y añadir los 170 ml de agua. Hacer 2 dobleces en la apertura y engrapar los extremos. Realizar movimientos para que el agua se distribuya en todo el arroz.
• Colocar las fundas en el autoclave cuidando de no llenarlo demasiado: debe haber fácil circulación de vapor. Autoclavar a 121 °C y 15 libras de presión por una hora.
• Sacar del autoclave y remover las fundas procurando que no haya aglomeraciones.

Inoculación del sustrato.

La inoculación debe realizarse en un ambiente cerrado y si es posible dentro de una cámara de flujo laminar. Si no se dispone de cámara se debe efectuar entre 2 mecheros, siempre en ambiente cerrado y trabajando en total asepsia.

• Cuando el sustrato ya está frío desinfectar el extremo doblado de la funda, separar sus bordes con cuidado e inocular 30 ml del cultivo líquido (de 3 días).
• Cerrar nuevamente las fundas y ayudar a distribuir el inóculo en todo el sustrato.

Incubación del sustrato.

• Ubicar las fundas inoculadas en el área destinada a incubación, la misma que debe tener una temperatura de 24–28 °C en oscuridad para incentivar el crecimiento de micelio.
• Al segundo día de incubación remover el contenido de las fundas para oxigenarlo.
• Incubar por 5–8 días (o más si es necesario) hasta lograr la esporulación completa. En este punto se requiere una alta humedad relativa (HR): 80 %.
• Revisar diariamente las fundas para eliminar aquellas con crecimiento lento o débil y las contaminadas.
• Abrir las fundas para permitir que disminuya la humedad.

Etapa de secado.

• Someter al hongo a una temperatura de 17–18 °C para favorecer su secado. Se puede también colocar un extractor de humedad.
• Permitir que la humedad del arroz baje al 4–6 % para cosecha de esporas o 15 % para producto en arroz, lo cual puede tomar entre 5, 6 y hasta 15 días, dependiendo de las condiciones.
• El producto está listo cuando al frotar el arroz con el hongo entre los dedos hay desprendimiento de conidias en forma de polvo.
• En este punto se realiza la cosecha de esporas con un cosechador (equipo) o se lo puede empacar directamente;
• Se almacena el producto a una temperatura de alrededor de 18–20 °C.

Control de calidad.

Cada lote de producción debe ser sometido a un riguroso control de calidad que determine la eficacia del producto obtenido en función de la concentración alcanzada, la viabilidad y la posible contaminación.

Hay que tomar en cuenta que se está trabajando con organismos vivos por lo que cada lote tendrá sus características propias.

Los criterios de calidad o parámetros que debería alcanzar el producto son:

• Concentración de conidias igual o mayor a 1 × 109 conidias por gramo de producto.
• Viabilidad igual o mayor al 95 %.
• Pureza mayor al 95 %.

Recuento de conidias.

Para el recuento de conidias se preparan diluciones seriadas en base 10 para conseguir que no estén aglomeradas y se las pueda contar.

Se lo realiza en la cámara de Neubauer que es un portaobjetos excavado en forma de H por lo que tiene 2 cámaras o secciones sobre cuya superficie de vidrio está marcada una cuadrícula con pequeños cuadros de área conocida.

Presenta 9 cuadrados principales de 1 mm por lado. El cuadrado central está divido en 25 Cuadrados Medianos (5 por lado), cada uno de los cuales a su vez está dividido en 16 cuadrados pequeños (4 por lado). Como el cuadrado central mide 1 mm por lado, el área total es de 1 mm2 por lo que cada cuadrado mediano mide 0,2 mm por  lado. Por último la distancia entre la cámara y el cubreobjetos es de 0,1 mm.

El procedimiento para el recuento de conidias es el siguiente:

• Formar una muestra compuesta tomando asépticamente y en forma aleatoria aproximadamente 1 gramo de 10 fundas del lote.
• De la muestra compuesta por 10 submuestras pesar 10 g y disolver con 90 ml de Tween 80 al 0,1 % estéril. Agitar en agitador orbital por 10 minutos o fuertemente en vórtex por 30 segundos para desprender las conidias del sustrato. De esta manera se obtiene la dilución 10-1.
• Realizar diluciones seriadas en base 10 tomando 1 ml de la dilución 10-1 y añadiéndolo a un tubo con 9 ml de Tween 80 al 0,1 % estéril. Agitar vigorosamente en el vórtex. Repetir el procedimiento hasta obtener la dilución 10-3.
• Lavar la cámara y el cubreobjetos con agua destilada y alcohol al 96 %. Secar bien con papel suave. Poner el cubreobjetos encima de la cámara.
• Homogeneizar bien la suspensión de conidias y tomar con pipeta Pasteur o automática una alícuota de la misma.
• Poner la punta de la pipeta en forma vertical en uno de los extremos de la H de la cámara junto al cubreobjetos y llenar la cámara sin permitir que se desborde ni que se formen burbujas de aire. Si esto sucede repetir la operación desde el principio.
• Fijar la cámara de recuento en la platina del microscopio para realizar la observación microscópica.
• Esperar dos minutos antes de contar para que las conidias se depositen en la cámara.
• Contar las conidias presentes en todo el cuadrado central o en 5 CM de los 25 que tiene el cuadrado central, los 4 de los extremos y el central.
• Aplicar la siguiente fórmula para obtener el recuento por gramo de producto:

* con recuento de todo el cuadrado central

* con recuento en los 5 CM del cuadrado central

donde:
fd = factor de dilución (la inversa de la dilución) 1 mm × 1 mm × 0,1 mm × 5/25 = dimensiones del área de recuento 5/25 = número de CM en los que se contó de los 25 CM que tiene el cuadrado principal central de la cámara.

Viabilidad o porcentaje de germinación.

Determina la concentración efectiva del producto. Expresa el porcentaje de conidias que están viables y por lo tanto germinan en un período determinado luego de sembradas en el medio de cultivo.

El procedimiento para determinar la viabilidad de un bioinsumo a base de hongos es el siguiente:

• Realizarlo utilizando todo el material estéril.
• Preparar agar-agua y esterilizarlo.
• Con una pipeta Pasteur estéril colocar alícuotas del medio en cada lado de un portaobjetos de manera que queden bien separadas.
• Sobre el medio colocar 10 µl de la dilución 10-3 bien homogeneizada preparada para la prueba anterior.
• Colocar esto en una cámara húmeda constituida por una caja Petri estéril con un papel filtro estéril en el fondo al que se añade agua estéril.
• Incubar a 28–30 °C por 20–24 horas.
• Colocar una gota de azul de lactofenol y observar al microscopio de luz o de contraste de fase con objetivo de 25 o 40 x.
• Realizar el recuento de conidias germinadas y no germinadas contando como mínimo 200.
• Calcular el porcentaje de germinación con la siguiente fórmula:

donde: a = número de conidias germinadas b = número de conidias sin germinar

• Se considera un producto satisfactorio con un porcentaje igual o mayor al 90 % de viabilidad.

Pureza.

Esta prueba determina la proporción del agente biológico y de los posibles contaminantes en el producto. El procedimiento es el siguiente:

• Preparar diluciones seriadas en base 10 hasta 10-5.
• Inocular 50 µl de la dilución 10-5 por triplicado en cajas con PDA y estriar con el asa de Drigalski (o rastrillo bacteriológico) para dispersar el inóculo homogéneamente en toda la caja.
• Incubar a 28 °C por 7 días.
• Contar diariamente el número de colonias (UFC) del hongo en cuestión y de otros microorganismos (hongos, bacterias y levaduras);
• Calcular el porcentaje de pureza con la fórmula:

Fuente: Ministerio de Agricultura, Ganadería, Pesca y acuacultura del Ecuador.

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